3D生物打印咋实现?重组弹性蛋白来助力!

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作者
筋斗云
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Human-Recombinant-Elastin-Based Bioinks for 3D Bioprinting of Vascularized Soft Tissues是发表于《ADVANCED MATERIALS》上的一篇文章,介绍了一种基于重组人原弹性蛋白的生物墨水,用于3D生物打印复杂软组织。该生物墨水由GelMA和MeTro组成,具有高生物相容性。通过测试,其机械性能良好,可打印性强,细胞相容性高。用该生物墨水打印的血管化心脏组织模型,在体外呈现出内皮屏障功能和心脏细胞自发跳动,体内降解和生物相容性良好。该研究展示了MeTro/GelMA生物墨水在打印3D功能性心脏组织方面的潜力,但3D打印工程器官仍面临挑战。

*本文只作阅读笔记分享*

一、引言

组织工程在解决器官移植短缺、药物筛选以及研究生物功能等方面具有巨大潜力,但传统平面制造技术难以创建复杂的多尺度架构,如血管内皮与周围结缔组织和实质细胞之间的界面,这限制了其对相应组织基本功能的研究。

例如,在一项研究中,Dvir和同事3D生物打印了一个脱细胞ECM水凝胶成血管化心脏模型,但该构建体未在体外长期灌注,且封装细胞的活力和功能未被报道。

二、基于重组人原弹性蛋白的生物墨水

(一)材料选择

我们提出了一种高度生物相容的重组人原弹性蛋白基生物墨水,用于3D生物打印复杂的软组织。该生物墨水由两种ECM基生物聚合物 gelatin methacryloyl(GelMA)和 methacryloyl - substituted recombinant human tropoelastin(MeTro)组成,可通过可见光交联。

弹性纤维对脊椎动物组织至关重要,如血管、皮肤、肺和心脏,原弹性蛋白的弹性源于其分子间排列,由交替的疏水和亲水结构域(包括赖氨酸残基)控制。此外,原弹性蛋白提供细胞结合基序和细胞信号通路,支持内皮细胞募集和生长,在迁移和血管生成中起重要作用。

明胶作为生物墨水的基础材料,具有许多类似于胶原蛋白的特性,如细胞结合位点和MMP降解位点。体内弹性蛋白通过原弹性蛋白的赖氨酸残基酶交联合成,而重组人原弹性蛋白可化学修饰为MeTro,可光聚合形成高弹性水凝胶,明胶骨架也可化学功能化为GelMA。

(二)机械性能测试

通过拉伸和压缩测试,发现MeTro/GelMA水凝胶的拉伸模量高于纯MeTro水凝胶,低于纯GelMA水凝胶;延展性和极限应力值呈现相反趋势;压缩模量介于纯GelMA和纯MeTro水凝胶之间。能量损失计算表明,MeTro的加入增加了复合水凝胶的弹性。

三、生物墨水的性能测试

(一)流变性能与可打印性

原本MeTro/GelMA溶液的粘度约为162.6 mPa·s,添加明胶后,粘度超过3000 mPa·s,提高了20倍,呈现出非牛顿行为和高储能模量。

通过FRESH打印技术和优化打印参数(15kPa压力和30mm/s速度,8 - 10°C温度),实现了复杂结构的打印,生物墨水流出喷嘴顺畅,可打印多层结构(如16层晶格结构)且具有可靠的打印保真度。

(二)细胞相容性

使用不同细胞类型进行测试,如3T3细胞、心肌细胞(CMs)、心脏成纤维细胞(CFs)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。在2D和3D培养条件下,细胞活力均较高(> 90%),且不影响细胞表型,如CMs表达肌节α - 肌动蛋白,HUVECs表达CD31。

四、血管化心脏组织的3D生物打印

(一)模型构建

制备两种生物墨水:加载CFs/CMs和HUVECs的GelMA生物墨水代表实质心脏组织;加载HUVECs的MeTro/GelMA生物墨水用于血管形成。

构建的心脏组织模型由67层组成,长、宽为7.2mm,高为16.5mm,生物打印过程约11分钟,光交联3分钟。

(二)体外分析

细胞活力:培养15天内,CFs/CMs和HUVECs的活力高于85%。

细胞表型:通过免疫荧光染色证实细胞表型保持良好,内皮细胞在整个构建体中增殖,CMs相互连接。

内皮屏障功能:HUVECs负载结构的扩散渗透性降低约2倍,证实了内皮的屏障功能。

心脏兴奋 - 收缩耦合(EC耦合):从第5天开始观察到CMs收缩,15天内收缩变得更加同步,跳动频率和协调度达到42.0 ± 3.1 bpm和73.1 ± 3.2%。

五、体内降解和生物相容性评估

将3D打印的MeTro/GelMA和GelMA生物墨水的无细胞构建体皮下植入大鼠,结果表明:

植入后21天平均生物降解率为67.4 ± 11.9%,组织学染色显示有效生物降解和与周围组织的显著整合。

第7天观察到纤维囊,但14和21天后消失,表明炎症反应极小。

免疫组织化学染色显示第7天有CD3和CD68抗原浸润,但21天后反应消失,证明打印构建体的生物相容性高。

六、结论

我们首次使用重组人原弹性蛋白结合明胶作为弹性生物墨水进行3D生物打印,构建的血管化心脏组织在体外和体内表现出良好的性能,证明了MeTro/GelMA生物墨水在打印复杂的3D功能性心脏组织方面的潜力,但3D打印在工程整个器官方面仍面临挑战。

参考文献

Lee S, et al. Human-Recombinant-Elastin-Based Bioinks for 3D Bioprinting of Vascularized Soft Tissues. Adv Mater. 2020 Nov;32(45): e2003915.

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